脑疟疾是恶性疟原虫感染最严重的神经血管并发症，即使在使用有用抗疟药休养后仍具有高牺牲率，当今对其发病机制的相识仍存在要紧局限。血脑樊篱（BBB）模子的不及严重阻碍了该规模的发展，传统体外模子使用单一内皮细胞培养，樊篱特点弱，无法确凿模拟体内复杂的多细胞界面和机械 cues。本策动告捷设备了一种立异的三维血脑樊篱（3D-BBB）模子，该模子整合了原代东说念主脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞，通过微流控时代在胶原水凝胶中构建出更接近生理情状的微血管相聚。该模子的改良价值在于其显赫增强的樊篱功能，为策动寄生虫介导的血管阻扰机制提供了前所未有的可靠平台。本文聚焦于光学成像与单细胞转录组时代的消亡应用，系统揭示了恶性疟原虫逸落发具通过下调贯穿卵白、激活炎症通路阻扰樊篱完好性的新机制，并考据了JAK-STAT遏制剂Ruxolitinib的休养后劲，为脑疟疾的赞成休养提供了新的场地。

本策动中枢时代的特有机制在于构建了一个高度仿生的三维微血管系统。该时代通过软光刻和打针成型相消亡的时势，在I型胶原水凝胶中预图案化生成微流控13×13网格相聚，创造了复杂的微流体通说念结构。

要道时代旨趣包含三个立异点：最初选拔多细胞共培养计谋，将原代东说念主星形胶质细胞和脑血管周细胞事先莳植在胶原溶液中，造成撑抓基质，尔后在原代东说念主大脑微血管内皮细胞在重力运转流下接种到微流控汇会聚，造成完好的三维结构；其次诈欺先进的光学成像时代进行质地考据，通过共聚焦显微镜对特异性记号物（PECAM-1、vWF、VE-cadherin用于内皮细胞，PDGFRβ、NG2用于周细胞，GFAP、S100B、AQP4用于星形胶质细胞）进行成像，证据各式细胞的正确定位和时势特征；第三是成建功能评估体系，通过70 kDa FITC-葡聚糖通透性实验定量评估樊篱完好性，施展该模子比较内皮细胞单独培养模子具有显赫裁减的通透性（2.15×10⁻⁶ cm/s vs 8.31×10⁻⁶ cm/s），证实其增强的樊篱特点。

策动团队告捷构建了一个更接近东说念主体确凿生理情状的生物工程化3D微血管模子。该模子在I型胶原水凝胶中制造，通过软光刻和打针成型时代预图案化造成一个微流控相聚。将原代东说念主星形胶质细胞和脑血管周细胞事先莳植在胶原溶液中，再将原代东说念主脑微血管内皮细胞在重力运转流下接种到微流控汇会聚，从而造成了一个三维共培养体系。经过免疫荧光染色恣意，三种细胞均抒发了其特有的记号物：内皮细胞抒发PECAM-1、vWF、VE-cadherin和β-catenin；周细胞抒发PDGFRβ和NG2；星形胶质细胞则抒发GFAP、S100B和AQP4。共聚焦显微镜成像夸耀，内皮细胞造成了可灌输的微血管，并被星形胶质细胞和周细胞包裹，再现了体内BBB的三维结构和架构。

该模子的要道上风在于其显赫增强的樊篱功能。定量RT-PCR测量夸耀，与星形胶质细胞和周细胞以7:3比例共培养后，内皮细胞中BBB特异性记号物的抒发随时期加多，包括精细贯穿记号物（OCLN, CLDNs）、BBB转运卵白（LRP1, SLC家眷）和外排泵（PGP, ABC家眷），并在培养7天后达到峰值。功能实考据明，含有周细胞和星形胶质细胞的3D-BBB模子对70 kDa FITC-葡聚糖的通透性显赫裁减，其通透性值（2.15x10⁻⁶ cm/s）显赫低于仅含内皮细胞的模子（8.31x10⁻⁶ cm/s）。这种增强的樊篱特点为策动恶性疟原虫指令的血管樊篱阻扰机制提供了特有而可靠的平台。

策动的中枢之一是研讨疟疾寄生虫逸落发具对BBB的影响。团队制备了含有同步化裂殖体期感染红细胞（iRBC）逸落发具的溶液（iRBC-egress media），并将其用于处理3D-BBB微血管。通过多模态分析，包括对解离微血管的单细胞RNA测序（scRNA-seq）、固定微血管的电子显微镜和共聚焦显微镜查验，以及及时通透性测量，全面评估了其影响。

scRNA-seq分析揭示了知晓于iRBC-逸出介质后，三种细胞类型的转录谱发生了变嫌。内皮细胞的各异基因抒发分析夸耀，多个对BBB完好性至关遑急的基因抒发显赫裁减，包括精细贯穿基因CLDN5（Claudin-5）、TJP1（ZO-1）和粘附贯穿转录本CDH5（VE-cadherin）。基因试验（GO-term）富集分析标明，内皮细胞中大广阔下调的转录本与内皮细胞贯穿和粘附、细胞骨架组织、血管发育、DNA成立、染色质组织和Wnt信号传导联系。

这些转录变化平直导致了时势和功能的改变。透射电镜（TEM）分析夸耀，天然完好细胞战役区域的精细贯穿长度莫得显赫各异，但知晓于iRBC-逸出介质的3D-BBB微血管中，超结构间隙的百分比显赫更高。共聚焦显微镜不雅察也证实了这少量，VE-cadherin染色夸耀出改变的粘附贯穿模式，发达为贯穿染色变细和大限制的内皮间瑕疵造成。功能上，经过24小时处理后，3D-BBB微血管对70 kDa FITC-葡聚糖的微血管通透性比率显赫加多了6.5倍。这些效力强有劲地标明，恶性疟原虫-iRBC家具裁减了精细贯穿和粘附贯穿记号物的抒发，改变了细胞间贯穿的时势，并导致了血管樊篱完好性的功能毁伤。

策动另一个遑急发现是寄生虫逸落发具能指令BBB扫数细胞类型发生激烈的炎症响应。scRNA-seq分析夸耀，知晓于iRBC-逸出介质引起了与炎症和抗原呈递通路联系的多个基因的上调。这种上调在扫数三种细胞类型中均存在，教唆iRBC-逸出介质有后劲穿过内皮樊篱。

上调的转录本包括参与I型搅扰素（IFN）响应的基因，如IFIT基因家眷成员（IFIT1, IFIT2, IFIT3）、搅扰素刺激基因（ISGs）（如ISG15, ISG20）和其他IFN指令基因（如MX1, IFI6, IFI27, OAS1），以及ferroptosis基因（如HMOX1）。此外，JAK-STAT家眷的信号转导子（STAT1, STAT2, JAK2）过火一些相互作用卵白的转录本也被上调。

抗原呈递是一个在扫数BBB构成细胞中激烈 elevated 的遑急炎症联系进程。TEM左证夸耀内皮细胞存在吸收寄生虫物资的迹象，造成了含有iRBC膜或hemozoin的大空泡。免疫荧光染色夸耀寄生虫核酸与溶酶体联系膜卵白1（LAMP1）共定位，标明寄生虫物资被运载到了内皮细胞的溶酶体区室。团队进一步界说了抗原呈递的转录组基因特征（MHC I类和MHC II类转录本）。内皮细胞和星形胶质细胞均发达出MHC I类基因特征的刚劲上调，而MHC II类抗原呈递基因特征（与CD4+ T细胞招募联系）也在内皮细胞中激烈上调，在星形胶质细胞和周细胞中限制上调。

为了更潜入了解信号通路的变化，团队使用了PROGENy筹画时势来基于下贱基因抒发料到信号通路活性。效力与GO-term分析一致，不雅察到NFkB和TNFα信号在内皮细胞和周细胞中的加多。值得堤防的是，JAK-STAT通路在扫数细胞类型中均被激活。通过免疫荧光染色对STAT1的考据标明，与对照组比较，知晓于寄生虫逸落发具后，3D-BBB模子中STAT1抒发加多，且不仅发生在于内皮细胞，也发生在胶原水凝胶中的撑抓周细胞和星形胶质细胞中，标明模子对iRBC-逸出介质产生了举座响应。在2D单层细胞中进一步评估了STAT1向核的易位，手脚通路活性加多的代理野心，发现内皮细胞核STAT1定位加多。

鉴于JAK-STAT通路在介导血管功能阻拦中的遑急性，团队评估了其休养后劲。使用临床批准的JAK1/2遏制剂Ruxolitinib处理3D-BBB微血管。免疫荧光染色证实，Ruxolitinib约束了由恶性疟原虫逸出介质指令的STAT1抒发加多。此外，该药物还在知晓于恶性疟原虫逸落发具的微血管中保留了精细贯穿卵白ZO-1的贯穿定位。

更遑急的是，这些时势学上的改善与3D-BBB樊篱功能的改善联系。通过70 kDa FITC-葡聚糖灌输评估微血管通透性发现，天然Ruxolitinib在对照组中仅 modestly 改善了基线通透性，但其在病理条款下的影响更为显赫。与iRBC-逸出介质共同孵育导致微血管通透性比单独使用iRBC-逸出介质条款裁减了近24倍。这些效力突显了JAK-STAT通路在恶性疟原虫介导的樊篱阻扰中的遑急性，并撑抓了Ruxolitinib在减少与脑疟疾联系的脑血管功能阻拦方面的休养后劲。

刻下三维血脑樊篱模子虽显赫优于传统模子，但仍濒临多项临床变嫌阻拦。模子构建复杂且需要熏陶丰富的实验室进行恒久培训，遣散了其平日实行；尽管樊篱特点有所改善，但与原生理通透率仍有差距，这主要与原代内皮细胞中精细贯穿卵白如Claudin-5和Occludin的固有低抒发联系。

将来策动场地应聚焦于时代优化与立异，包括选拔指令多颖悟细胞（iPSC）开始的脑内皮细胞进步樊篱性能，但需处理其上皮样特点问题，通过过抒发ETV2、FLI1、ERG等ETS因子或FOXF2和ZIC3等转录因子可改善血管表型；模子复杂性也需进一步增强，引入小胶质细胞、神经元等其他脑细胞类型，以及免疫细胞和血流剪切力等生理成分，以更全面模拟体内环境。

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